Hvad er en polymerasekædereaktion (pcr)? fakta om test, trin & brugt til

Hvad er PCR (polymerasekædereaktion)?

Polymerase-kædereaktion (PCR) er en teknik, der bruges til at amplificere spormængder af DNA (og i nogle tilfælde RNA) placeret i eller på næsten enhver væske eller overflade, hvor DNA-strenge kan deponeres. Nøglen til at forstå PCR er at vide, at ethvert menneske, dyr, plante, parasit, bakterie eller virus indeholder genetisk materiale såsom DNA (eller RNA) -sekvenser (nukleotidsekvenser eller stykker DNA eller RNA), der er unikke for deres arter, og til det enkelte medlem af denne art. Følgelig, hvis en prøve indeholder segmenter af DNA eller RNA, er PCR en metode, der bruges til at amplificere (fremstille mange flere identiske kopier) af disse unikke sekvenser, så de derefter kan bruges til at bestemme med en meget stor sandsynlighed for kildens identitet (a specifik person, dyr eller patogen organisme) af spor-DNA eller RNA fundet i eller på næsten enhver prøve af materiale.

PCR-forstærkning er dog kun en del af den identificerende test. Når amplificeringen er udført (se nedenfor), skal de amplificerede segmenter sammenlignes med andre nukleotidsegmenter fra en kendt kilde (for eksempel en bestemt person, et dyr eller en patogen organisme). Denne sammenligning af unikke segmenter foretages ofte ved at placere PCR-genererede nukleotidsekvenser ved siden af ​​kendte nukleotidsekvenser fra mennesker, patogener eller andre kilder i en separerende gel. Elektrisk strøm ledes gennem gelen, og de forskellige nukleotidsekvenser danner bånd, der ligner en "stige" i henhold til deres elektriske ladning og molekylstørrelse. Dette kaldes gelelektroforese. Bånd eller "stige" som trin, der migrerer til de samme niveauer i gelen, viser identiteten af ​​nukleotidsekvenser. Denne metode er en af ​​de mest populære måder, hvorpå PCR-test er afsluttet (se fig. 1).

Figur 1, bånd eller "stige" som trin af PCR produceret DNA af Mycobacterium (høflighed af CDC)

Figur. Gentagne elementer (Rep) –PCR (A) og pulserende feltelektroforese (PFGE) (B) mønstre af Mycobacterium cosmeticum isolater fra 2 patienter i Ohio og 1 patient i Venezuela. Rep-PCR blev udført ved anvendelse af BOXA1R-primer (3), og PFGE blev udført med restriktionsenzym AseI. Bane 1, 2, Ohio isolerer OH1 og OH2; bane 3, 4, kontrolstammer ATCC BAA-878T og ATCC BAA-879; bane 5, venezuelansk isolering VZ1. DNA-størrelsesstandarder er 100 bp (S1) og 48, 5 kb markør (S2).

Hvordan gøres PCR (polymerasekædereaktion)?

I 1983 regnede Kary Mullis ud med de grundlæggende trin til amplificering af DNA-sekvenser. Han og Michael Smith blev tildelt Nobelprisen for at udvikle denne procedure i 1993. Der er et par grundlæggende trin, der følges i rækkefølge; PCR kan udføres i et enkelt rør med passende kemikalier og en specielt designet varmeovn. De nødvendige reagenser eller kemikalier er som følger:

• En prøve, der indeholder en nukleotidsekvens (fra blod, hår, pus, hudskrabning osv.)
• DNA-primere: kort, enkeltstrenget DNA, der fastgøres til nukleotidsekvenser, der fremmer syntesen af ​​en komplementær streng af nukleotider
• DNA-polymerase: et enzym, der, når DNA'et har en primer bundet, går ned ad DNA-segmentet, der binder DNA-byggesten til dannelse af komplementære basepar og således syntetiserer en komplementær nucleotidstreng af DNA (introduktionen af ​​en varmebestandig DNA-polymerase, Taq polymerase, afledt af varmebestandige bakterier, forbedrede markant evnen til at udføre PCR markant
• Et stort overskud af DNA-byggesten, der kaldes nukleotider (henholdsvis Adenine, Thymidine, Cytosin og Guanine, forkortet som: A, T, C og G) er til stede i opløsningen. Når disse blokke er bundet sammen, danner de en nukleotidsekvens eller en enkelt DNA-streng. Når disse byggeklodser binder deres komplementære byggesten med svage brintbindinger (for eksempel vil A kun binde til T og G kun med C) dannes en komplementær DNA-nukleotidsekvens og bindes til det originale enkeltstrengede DNA. Når bindingen er afsluttet, dannes et komplementært dobbeltstrenget DNA i en specifik sekvens.

PCR begynder derefter med et segment af DNA fra en prøve, der anbringes i et rør med de ovenfor angivne reagenser. Opløsningen opvarmes til mindst 94 ° C (201, 2 F); denne varme bryder hydrogenbindingerne, der tillader komplementære DNA-strenge at dannes, så der findes kun enkeltstrenge i blandingen (dette kaldes denaturering af dobbeltstrenget DNA).

Blandingen afkøles til ca. 54 ° C. Ved denne temperatur binder DNA-primerne og DNA-polymerase til individuelt enkeltstrenget DNA (dette kaldes annealing af DNAet). Fordi byggestenene er i overskydende (høj koncentration) i blandingen, bruger polymerasen dem til at fremstille nye komplementære DNA-strenge (kaldet forlængelse af DNA), og denne proces er hurtigere ved 72 ° C (161, 6 F). Denne proces skaber et nyt dobbeltstrenget DNA-molekyle fra hver af de enkelte tråde i det originale molekyle.

Denne cyklus gentages ca. 40 gange i en maskine, der kaldes en termisk cycler, der automatisk gentager opvarmningskølingcyklusserne, med mængden af ​​hver DNA-sekvens, der fordobles hver gang varmekølingcyklussen er afsluttet. Hvad der oprindeligt var et enkelt kort segment af DNA, kan amplificeres til ca. 100 milliarder eksemplarer efter 40 fordoblingscyklusser.

Hvorfor skulle en læge bestille en PCR-test (polymerasekædereaktion)?

PCR-test danner grundlaget for et antal test, der kan besvare mange forskellige medicinske spørgsmål, der hjælper læger med at diagnosticere og behandle patienter. F.eks. Kan PCR-test påvise og identificere patogene organismer hos patienter, især dem, der er vanskelige at dyrke (for eksempel HIV og andre vira og visse svampe).

Andre læger bestiller PCR-test for at hjælpe med at diagnosticere genetiske sygdomme, mens andre læger bruger PCR til at opdage biologiske forhold såsom identificering af forældre til børn. PCR-test bruges også til at identificere og karakterisere genetiske mutationer og omarrangementer, der findes i visse kræftformer.

Imidlertid er PCR-test blevet modificeret og udvidet til mange aspekter af videnskabelige undersøgelser, herunder evolutionær biologi, genetisk fingeraftryk, retsmedicinske undersøgelser og mange andre.

Hvad er RT-PCR?

RT-PCR er en PCR-test, der er designet til at detektere og måle RNA. Selvom initial PCR-test amplificerede DNA, bruger mange vira og andre biologiske komponenter (for eksempel mitokondrier) RNA som deres genetiske materiale. RT-PCR adskiller sig fra konventionel PCR ved først at tage RNA og omdanne RNA-strengen til en DNA-streng. Dette gøres ved i det væsentlige den samme metode til PCR beskrevet ovenfor med undtagelse af at anvende en enzym benævnt revers transkriptase i stedet for DNA-polymerasen. Den omvendte transkriptase tillader, at en enkelt streng af RNA oversættes til en komplementær streng af DNA. Når denne reaktion finder sted, kan den rutinemæssige PCR-metode derefter bruges til at amplificere DNA'et. RT-PCR er blevet brugt til at detektere og studere mange RNA-vira.

RT-PCR bør ikke forveksles med en anden variation af PCR, kaldet Real-Time PCR. Real-Time PCR er en variation af PCR, der tillader analyse af det amplificerede DNA i de sædvanlige 40 cyklusser af proceduren. Selvom proceduren ligner konventionel PCR ved cykling, bruger Real-Time PCR fluorescerende farvestoffer bundet til nogle af byggestenene eller små nukleotidstrenge. Afhængig af den anvendte metode forekommer fluorescens, når de amplificerede DNA-strenge dannes. Mængden af ​​fluorescens kan måles gennem de 40 cyklusser og giver undersøgerne mulighed for at måle specifikke produkter og deres mængder under amplificeringscyklusserne. Dette gør det ofte muligt for efterforskere eller laboratorieteknikere at springe over gelelektroforese eller andre sekundære procedurer, der er nødvendige til analyse af PCR-produkterne, hvilket giver hurtigere resultater.

PCR i realtid og RT-PCR er variationer eller ændringer af den originale PCR-test. Der er dog mange flere variationer (mindst 25), der findes og bruges til at løse specifikke problemer. De har alle forskellige navne såsom Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-fase PCR og mange andre.

PCR vil sandsynligvis fortsat blive ændret for at hjælpe med at besvare eventuelle andre spørgsmål inden for medicin, biologi. og andre studieretninger.